Мишина Н. Н., Штыров И. Н., Семенов Э. И., Василевский Н. М. Оптимизация протокола иммуноферментного анализа для индикации Т-2 токсина // Научная жизнь. 2020. Т. 15. Вып. 4. С. 551–560. DOI: 10.35679/1991-9476-2020-15-4-551-560

Мишина Наиля Наримановна, канд. биол. наук, вед. науч. сотр. лаборатории микотоксинов, ФГБНУ «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности»: Россия, 420075, Республика Татарстан, г. Казань, Научный городок, 2.

Штыров Иван Николаевич, аспирант лаборатории микотоксинов, ФГБНУ «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности»: Россия, 420075, Республика Татарстан, г. Казань, Научный городок, 2.

Семенов Эдуард Ильясович, канд. биол. наук, зав. отделением токсикологии, ФГБНУ «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности»: Россия, 420075, Республика Татарстан, г. Казань, Научный городок, 2.

Василевский Николай Михайлович, д-р ветеринар. наук, профессор, зам. директора по научной работе и инновационному развитию, ФГБНУ «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности»: Россия, 420075, Республика Татарстан, г. Казань, Научный городок, 2.

Тел.: (843) 239-53-20

E-mail: MishinaNailyaN@yandex.ru

Т-2 токсин является одним из наиболее распространенных и токсичных трихотеценовых микотоксинов – вторичных метаболитов плесневых грибов, развивающихся на зерновых и некоторых других сельскохозяйственных культурах. В данной статье рассмотрен этап разработки тест-системы для определения Т-2 токсина на основе твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA), в котором используется ферментная метка – конъюгат антикроличьих козьих антител с пероксидазой. Важным этапом создания любой тест-системы на основе ИФА является предварительное титрование компонентов реакции. Целью работы стало определение оптимальной концентрации конъюгата антивидовых антител в непрямом конкурентном иммуноферментном виде ИФА при индикации Т-2 токсина. Был рассмотрен ряд разведений конъюгата антивидовых антител: 1 : 1000; 1 : 2000; 1 : 3000; 1 : 4000; 1 : 5000; 1 : 7500; 1 : 10000; 1 : 12 500; 1 : 15 000; 1 : 17 500; 1 : 20 000; 1 : 30 000. В протоколе постановки ИФА использовали калибровочные растворы Т-2 токсина в концентрациях 0,0; 2,5; 5, 10, 20, 40, 80, 160 нг/мл и специфические поликлональные кроличьи антитела к конъюгату Т-2-БСА. На основании средних значений оптической плотности строили калибровочные графики через процент поглощения сигнала от нулевого стандарта. При оценке результатов исследования критерием выбора разведения конъюгата антивидовых антител считали наибольшее, при котором достигается лучшая линейность градировочного графика и был бы наиболее низким уровень неспецифической реакции его с нулевым стандартом. Установлено, что оптимальными вариантами разведениями конъюгата антивидовых антител в одинаковых испытанных условиях эксперимента являлись 1 : 4000, 1 : 5000 и 1 : 12 500. Дозозависимое поглощение сигнала наблюдалось во всех концентрациях антивидовых антител. Разведения конъюгата антивидовых антител 1 : 1000–1 : 3000 и 1 : 17 500–1 : 30 000 не учитывались, так как оптическая плотность большинства лунок была выше оптимальных границ в первом случае (> 3,9) и ниже – во втором (< 0,4). На основании вышеизложенного оптимальным разведением конъюгата антивидовых антител было выбрано 1 : 12 500.

Список литературы:

1. Агольцов В. А., Попова О. М., Калюжный И. И. Клинические и клинико-лабораторные изменения при ассоциированном микотоксикозе коров, вызванном Т-2 токсином Fusarium sporotrichioides и Aspergillus fumigatus и их коррекция // Аграрный научный журнал. – 2015. – № 10. – С. 3–5.

2. Буркин А. А., Кононенко Г. П. Иммуноферментный анализ альтернариола для оценки риска контаминации агропродукции // Прикладная биохимия и микробиология. – 2011. – Т. 47, № 1. – С. 79–83.

3. Закирова Г. Ш., Папуниди К. Х., Валеев А. Р., Ямалова Г. Р., Гришин Н. С. Разработка способа экспресс пробоподготовки для анализа пиретроидов и микотоксинов в зерне методом газожидкостной хроматографии // Ветеринарный врач. – 2017. – № 3. – С. 26–29.

4. Матросова Л. Е., Ермолаева О. К, Иванов А. А. Мониторинг микроскопических грибов в сельскохозяйственной продукции Республики Татарстан // Ветеринарный врач. – 2009. – № 3. – С. 52–53.

5. Мишина Н. Н., Семенов Э. И., Папуниди К. Х. Применение конъюгата Т-2 токсина с полилизином для обнаружения Т-2 токсина в конкурентном ИФА // Ветеринарный врач. – 2017. – № 4. – С. 33–40.

6. Мишина Н. Н., Семенов Э. И., Папуниди К. Х., Потехина Р. М., Танасева С. А., Ермолаева О. К., Сагдеева З. Х., Гатауллин Д. Х. Влияние комплекса цеолита и шунгита на резистентность и продуктивность цыплят-бройлеров при смешанном микотоксикозе // Ветеринарный врач. – 2018. – № 6. – С. 3–9.

7. Папуниди К. Х., Тремасов М. Я., Фисинин В. И. [и др.] Микотоксины (в пищевой цепи) : монография; 2-е изд., перераб. и доп. – Казань : ФГБНУ «ФЦТРБ-ВНИВИ», 2017. – 188 с. 

8. Сапринская Н. В., Домницкий И. Ю., Агольцов В. А., Попова О. М. Клинические и патоморфологические изменения при спонтанном ассоциированном Т-2 и аспергиллотоксикозе кур // Научная жизнь. – 2016. – № 8. – С. 27–39.

9. Тремасов М. Я., Иванов А. В., Тарасова Е. Ю. Микотоксины – реальная угроза продовольственной безопасности // Вестник ветеринарии. – 2013. – № 2(65). – С. 78–80.

10. Chauhan R., Singh J., Sachdev T., Basu T., Malhotra B. D. Recent advances in mycotoxins detection // Biosensors and Bioelectronics. – 2016. – Vol. 81. – P. 532–545.

11. Kohl T. O., Ascoli C. A. Indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) // Cold Spring Harbor Protocols. – 2017. – № 7. DOI: 10.1101/pdb.prot093757.

12. Oplatowska-Stachowiak M., Kleintjens T., Sajic N., Haasnoot W., Campbell K., Elliott C., Salden M. T-2 toxin/HT-2 toxin and ochratoxin A ELISAs development and in-house validation in food in accordance with commission regulation (EU) no 519/2014 // Toxins. – 2017. – Vol. 9, № 12. – P. 388. DOI: 10.3390/ toxins9120388.

13. Palomo C., Hamad S. Mycotoxins multi detection by ELISA // Biosaia. – 2016. – № 5. – P. 28.

14. Stob M. Naturally occurring food toxicants: estrogens // Handbook of naturally occurring food toxicants. – CRC Press, 2018. – P. 81–100.

15. Urusov A., Zherdev A., PetrakovaA., Sadykhov E., Koroleva O., DzantievB. Rapid multiple immune enzyme assay of mycotoxins // Toxins. – 2015. – Vol. 7, № 2. – P. 238–254. DOI: 10.3390/toxins7020238.

16. Zhang M., Huo B., Yuan S., Ning B., Bai J., Peng Y., Gao Z. Ultrasensitive detection of T-2 toxin in food based on bio-barcode and rolling circle amplification // Analyticachimicaacta. – 2018. – Vol. 1043. – P. 98–106.

ENZYME IMMUNOASSAY PROTOCOL OPTIMIZATION FOR T-2 TOXIN INDICATION

Mishina Nailya Narimanovna, Cand. of Biol. Sci., Leading Researcher, Mycotoxin Laboratory, Federal Center for Toxicological, Radiation and Biological Safety, Kazan, Russia. 

Shtyrov Ivan Nikolaevich, Post-graduate student, Mycotoxin Laboratory, Federal Center for Toxicological, Radiation and Biological Safety, Kazan, Russia.

Semenov Eduard Ilyasovich, Cand. of Biol. Sci., Head of Toxicology Depart., Federal Center for Toxicological, Radiation and Biological Safety, Kazan, Russia.

Vasilevskiy Nikolay Mikhaylovich, Dr. of Vet. Sci., Deputy Director on Research and Innovation Development, Federal Center for Toxicological, Radiation and Biological Safety, Kazan, Russia.

Keywords: ELISA, T-2 toxin, antibody, antigen, anti-species conjugate

Abstract. T-2 toxin is one of the most common and toxic trichothecene mycotoxins – secondary metabolites of molds that develop on cereals and some other crops. This article discusses the development stage of a test system for the determination of T-2 toxin based on enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), which uses an enzyme label – a conjugate of anti-rabbit goat antibodies with peroxidase. An important step in the creation of any ELISA-based test system is the preliminary titration of reaction components. The aim of the work was to determine the optimal concentration of the conjugate of antispecies antibodies in an indirectly competitive enzyme-linked immunosorbent enzyme immunoassay with the indication of T-2 toxin. A number of dilutions of the antivirus conjugate were examined: 1 : 1000; 1 : 2000; 1 : 3000; 1 : 4000; 1 : 5000; 1 : 7500; 1 : 10000; 1 : 12 500; 1 : 15,000; 1 : 17,500; 1 : 20,000; 1 : 30 000. In the ELISA staging protocol, calibration solutions of T-2 toxin at concentrations of 0.0 were used; 2.5; 5, 10, 20, 40, 80, 160 ng/ml and specific polyclonal rabbit antibodies to the T-2-BSA conjugate. Based on the average optical density values, calibration plots were constructed using the percentage of signal absorption from the zero standard. When evaluating the results of the study, the criterion for choosing the dilution of the conjugate of anti-species antibodies was considered the greatest, at which the best linearity of the grading plot is achieved and the level of its non-specific reaction with the zero standard would be the lowest. It was established that the optimal variants of dilutions of the conjugate of anti-species antibodies under the same experimental conditions tested were 1: 4000, 1 : 5000 and 1 : 12 500. Dose-dependent signal absorption was observed in all concentrations of anti-species antibodies. Dilutions of the conjugate of anti-species antibodies 1 : 1000–1 : 3000 and 1 : 17 500–1 : 30 000 were not taken into account, since the optical density of most wells was higher than the optimal boundaries in the first case (> 3.9) and lower in the second (< 0.4). Based on the foregoing, optimal dilution of the conjugate of anti-species antibodies was selected 1 : 12 500.