Кузнецова В. С., Иващенко С. В., Дыкман Л. А., Киреев М. Н., Хапцев З. Ю. Псевдотуберкулёзные сыворотки в ДОТ-иммуноанализе с золотыми наночастицами // Научная жизнь. 2023. Т. 18. Вып. 4 (130)

Кузнецова Вера Сергеевна, сотрудник кафедры «Микробиология и биотехнология», ФГБОУ ВО «Саратовский государственный университет генетики, биотехнологии и инженерии им. Н. И. Вавилова»: Россия, 410012, Саратовская обл., г. Саратов, пр-кт им. Петра Столыпина, зд. 4, стр. 3.
Иващенко Сергей Владимирович, канд. биол. наук, доцент, доцент кафедры «Микробиология и биотехнология», ФГБОУ ВО «Саратовский государственный университет генетики, биотехнологии и инженерии им. Н. И. Вавилова»: Россия, 410012, Саратовская обл., г. Саратов, пр-кт им. Петра Столыпина, зд. 4, стр. 3.
Дыкман Лев Абрамович, д-р биол. наук, вед. науч. сотр. лаборатории иммунохимии, Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов – обособленное структурное подразделение ФГБУН Федеральный исследовательский центр «Саратовский научный центр Российской академии наук»: Россия, 410049, Саратовская обл., Саратов, пр-кт Энтузиастов, 13.
Киреев Михаил Николаевич, канд. мед. наук, вед. науч. сотр. лаборатории холерных вакцин, ФКУН «Российский научно-исследовательский противочумный институт "Микроб" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека»: Россия, 410005, Саратовская обл., г. Саратов, ул. Университетская, 46.
Хапцев Заур Юрьевич, канд. биол. наук, доцент, доцент кафедры «Микробиология и биотехнология», ФГБОУ ВО «Саратовский государственный университет генетики, биотехнологии и инженерии им. Н. И. Вавилова»: Россия, 410012, Саратовская обл., г. Саратов, пр-кт им. Петра Столыпина, зд. 4, стр. 3.

Тел.: (908) 553-30-57
E-mail: ivashenko-sv@mail.ru

Для проведения эксперимента нами были получены два антигена: дезинтегрированные мембраны (ДМ) Yersinia pseudotuberculosis и липополисахарид (ЛПС) Y. pseudotuberculosis. ДМ представляли собой разрушенные ультразвуком и додецилсульфатом натрия бактериальные клеточные стенки. ЛПС был получен фенольным методом и не содержал примесей белка. Для получения гипериммунных сывороток крови была проведена пятикратная иммунизация кроликов данными антигенами. При иммунизации соотношение адъюванта к раствору антигена составляло 1:1. ДМ инъецировали кролику в количестве 2 мг, ЛПС – в количестве 0,25 мг. В качестве адъюванта использовали 1%-й раствор полиазолидинаммония, модифицированного гидрат-ионами йода. Полученные сыворотки были испытаны в дот-иммуноанализе (ДИА) с растворимыми и корпускулярными антигенами. В качестве корпускулярных антигенов выступали бактериальные взвеси с концентрацией 10⁹ клеток/мл. Индикаторной системой в ДИА служил конъюгат белка А с золотыми наночастицами размером 15,2 нм. Сыворотка, полученная к ЛПС Y. pseudotuberculosis, имела недостаточное количество антител для использования её в ДИА, в отличие от сыворотки к ДМ Y. pseudotuberculosis. Последняя сыворотка имела высокие титры антител в ДИА и обладала выраженной видовой специфичностью. Её титры антител в ДИА со штаммами Y. pseudotuberculosis О:1, О:3, О:4, О:5 серовариантов составили 1:1600-1:3200. С клетками Y. enterocolitica О:3, О:9 серовариантов, Enterobacter aerogenes, Escherichia coli, Proteus vulgaris, Salmonella typhimurium, Klebsiella pneumoniae взаимодействий сыворотки не наблюдалось. Коммерческие псевдотуберкулёзная и кишечноиерсиниозная О:3 сыворотки (из диагностических наборов для постановки РНГА) были менее активны в ДИА, чем экспериментальная сыворотка, полученная к ДМ Y. pseudotuberculosis. Таким образом, сыворотка, полученная иммунизацией кроликов ДМ Y. pseudotuberculosis, может быть использована в дальнейшем для создания псевдотуберкулёзной дот-иммунотест-системы.

Список литературы:

1. Псевдотуберкулез / Г. П. Сомов, В. И. Покровский, Н. Н. Беседнова, [и др.]. – М. : Медицина, 2001. – 256 с.

2. Псевдотуберкулез / И. А. Шурыгина, М. В. Чеснокова, В. Т. Климов [и др.]. – Новосибирск : Наука, 2003. – 320 с.
3. Золотые наночастицы: синтез, свойства, биомедицинское применение / Л. А. Дыкман, В. А. Богатырёв, С. Ю. Щёголев [и др.]. – М. : Наука, 2008. – 319 c.
4. Safarpour H. ,  Pourhassan-Moghaddam M.,  Spotin A. [et al.] A novel enhanced dot blot immunoassay using colorimetric biosensor for detection of Toxoplasma gondii infection // Comp. Immunol. Microbiol. Infect. Dis. – 2021. – Vol. 79. – 101708. doi: 10.1016/j.cimid.2021.101708.
5. Safarpour H. , Majdi H. ,  Masjedi A. [et al.] Development of Optical Biosensor Using Protein A-Conjugated Chitosan-Gold Nanoparticles for Diagnosis of Cystic Echinococcosis // Biosensors (Basel). – 2021. – Vol. 11, № 5. – 134. doi: 10.3390/bios11050134.
6. Ushkalenko N., Ersh A.,  Sergeev A. [et al.] Evaluation of Rapid Dot-Immunoassay for Detection Orthopoxviruses Using Laboratory-Grown Viruses and Animal's Clinical Specimens // Viruses. – 2022. – Vol. 14, № 11. – 2580. doi: 10.3390/v14112580.
7. Phan L. M. T.,  Rafique R.,  Baek S. H. [et al.]Gold-copper nanoshell dot-blot immunoassay for naked-eye sensitive detection of tuberculosis specific CFP-10 antigen // Biosens. Bioelectron. – 2018. – Vol. 121. – Р. 111-117. doi: 10.1016/j.bios.2018.08.068.
8. Raja V. ,  Prasad M.,  Bothammal P.,  Saranya P. [et al.] Silver enhanced nano-gold dot blot immunoassay for leptospirosis // J. Microbiol. Methods. – 2019. – Vol. 156. – Р. 20-22. doi: 10.1016/j.mimet.2018.11.021.
9. Загоскина Т. Ю., Чеснокова М. В., Климов В. Т.  [и др.] Конструирование тест-системы с наночастицами коллоидного серебра для обнаружения возбудителей псевдотуберкулеза и кишечного иерсиниоза в дот-иммуноанализе // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии (ЖМЭИ). – 2017. – Вып. 1. – С. 55-61.
10. Носкова О. А., Загоскина Т. Ю., Субычева Е. Н.  [и др.] Применение дот-иммуноанализа для выявления антигенов чумного микроба в полевом материале // Проблемы особо опасных инфекций. – 2014. – Вып. 3. – С. 69-71.
11. Kuznetsova V. S., Ivaschenko S. V., Domnitsky I. Y. Polyazolidinammonium as an adjuvant in immunization with lipopolysaccharide of Yersinia pseudotuberculosis // IOP Conf. Ser.: Earth Environ. Sci. – 2020. – Vol. 421. – 052022 doi: 10.1088/1755-1315/421/5/052022.
12. Ivaschenko S. V., Kuznetsova V. S., Savina S. V., Skorlyakov V. M. The effect of polyazolidinammonium on the dynamics of the synthesis of pseudotuberculosis antibodies // IOP Conf. Ser.: Eharth Environ. Sci. – 2020. – Vol. 421. – 022055. doi: 10.1088/1755-1315/421/2/022055.
13. Кульшин В. А., Яковлев А. П., Аваева С. Н., Дмитриев Б. А. Улучшенный метод выделения полисахаридов из грамотрицательных бактерий // Мол. генетика, микробиология, вирусология. – 1987. – № 5. – С. 44-46.
14. Frens G. Controlled nucleation for the regulation of the particle size in monodisperse gold suspensions // Nature Phys. Sci. – 1973. – Vol. 241. – P. 20-22.

PSEUDOTUBERCULOUS SERA IN DOT-IMMUNOASSAY WITH GOLD NANOPARTICLES

Kuznetsova Vera Sergeevna, Employee of the Depart. of Microbiology and Biotechnology, Saratov State University of Genetics, Biotechnology and Engineering named after N.I. Vavilov, Saratov, Russia.
Ivashchenko Sergey Vladimirovich, Cand. of Biol. Sci., Ass. Prof., Ass. Prof. of the Depart. of Microbiology and Biotechnology, Saratov State University of Genetics, Biotechnology and Engineering named after N.I. Vavilov, Saratov, Russia.
Dykman Lev Abramovich, Dr. of Biol. Sci., Leading Researcher of the Laboratories of Immunochemistry, Saratov Scientific Center of the Russian Academy of Sciences, Saratov, Russia.
Kireev Mikhail Nikolaevich, Cand. of Med. Sci., Leading Researcher of the Laboratories of cholera vaccines, Russian Research Anti-Plague Institute "Microbe", Saratov, Russia.
Khaptsev Zaur Yurievich, Cand. of Biol. Sci., Ass. Prof., Ass. Prof. of the Depart. of Microbiology and Biotechnology, Saratov State University of Genetics, Biotechnology and Engineering named after N.I. Vavilov, Saratov, Russia.

Keywords: Yersinia pseudotuberculosis, dot-immunoassay, gold nanoparticles, disintegrated membranes, lipopolysaccharide, antibodies.

Abstract. For the experiment, we obtained two antigens: disintegrated membranes (DM) of Yersinia pseudotuberculosis and lipopolysaccharide (LPS) of Y. pseudotuberculosis. DM represented bacterial cell walls destroyed by ultrasound and sodium dodecyl sulfate. LPS was obtained by the phenolic method and did not contain protein impurities. To obtain hyperimmune blood sera, five-fold immunization of rabbits with these antigens was carried out. During immunization, the ratio of adjuvant to antigen solution was 1:1. DM was injected into the rabbit in an amount of 2 mg, LPS – in an amount of 0.25 mg. A 1% solution of polyazolidinammonium modified with hydrate ions of iodine was used as an adjuvant. The obtained serums were tested in dot immunoassay (DIA) with soluble and corpuscular antigens. Bacterial suspensions with a concentration of 10⁹ cells/ml were used as corpuscular antigens. The indicator system in DIA was a conjugate of protein A with gold nanoparticles of 15.2 nm in size. Serum obtained by LPS Y. pseudotuberculosis, had insufficient antibodies to use it in DIA, unlike serum to DM Y. pseudotuberculosis. The last serum had high antibody titers in DIA and had a pronounced species specificity. Her antibody titers in DIA with Y. pseudotuberculosis strains O:1, O:3, O:4, O:5 serovariants were 1:1600-1:3200. No serum interactions were observed with Y. enterocolitica O:3, O:9 serovariants, Enterobacter aerogenes, Escherichia coli, Proteus vulgaris, Salmonella typhimurium, Klebsiella pneumoniae cells. Commercial pseudotuberculous and intestinal yersiniosis O:3 sera (from diagnostic kits for RNG diagnosis) were less active in DIA than the experimental serum obtained for DM Y. pseudotuberculosis. Thus, the serum obtained by immunization of rabbits with DM Y. pseudotuberculosis can be used in the future to create a pseudotuberculous DOT-immunotest system.