Малинов Евгений Сергеевич, соискатель, научный сотрудник, ФГБОУ ВО «Ульяновский государственный аграрный университет им. П. А. Столыпина»: Россия, 432017, Ульяновская обл., г. Ульяновск, бульвар Новый Венец, 1.

Шестаков Андрей Геннадьевич, канд. биол. наук, доцент, ФГБОУ ВО «Ульяновский государственный аграрный университет им. П. А. Столыпина»: Россия, 432017, Ульяновская обл., г. Ульяновск, бульвар Новый Венец, 1.

Молофеева Надежда Ивановна, канд. биол. наук, доцент кафедры «Микробиология, вирусология, эпизоотология и ветеринарно-санитарная экспертиза», ФГБОУ ВО «Ульяновский государственный аграрный университет им. П. А. Столыпина»: Россия, 432017, Ульяновская обл., г. Ульяновск, бульвар Новый Венец, 1.

Мерчина Светлана Васильевна, канд. биол. наук, доцент кафедры «Микробиология, вирусология, эпизоотология и ветеринарно-санитарная экспертиза», ФГБОУ ВО «Ульяновский государственный аграрный университет им. П. А. Столыпина»: Россия, 432017, Ульяновская обл., г. Ульяновск, бульвар Новый Венец, 1.

Васильев Дмитрий Аркадьевич, д-р биол. наук, профессор, зав. кафедрой «Микробиология, вирусология, эпизоотология и ветеринарно-санитарная экспертиза», ФГБОУ ВО «Ульяновский государственный аграрный университет им. П. А. Столыпина»: Россия, 432017, Ульяновская обл., г. Ульяновск, бульвар Новый Венец, 1.

Тел.: (842-31) 5-12-68

E-mail: jenek-malinin@rambler.ru

Работа была выполнена на базе кафедры микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ВСЭ ФГБОУ ВО «Ульяновский государственный аграрный университет им. П. А. Столыпина». В работе использованы традиционные микробиологические методы и разработанные авторами биологические модели и методики. В ходе проведения эксперимента авторы использовали референс штамм бактерий Pseudomonas aeruginosa «ГИСК» им. Л. А. Тарасевича 1677, полученный из музея кафедры микробиологии. Целью данной работы явилось исследование воздействия полигексаметиленгуанидина гидрохлорида на биопленки, образованные бактериями Pseudomonas aeruginosa, в искусственно созданной модели полноценной биопленки и последующего формирования персистеров. В данной статье описываются результаты научных исследований по использованию полигексаметиленгуанидина гидрохлорида в качестве средства деструкции биопленки, образованной бактериями Pseudomonas aeruginosa и воздействия супернатанта на последующее формирование клеток персистеров. Авторская методика и разработанные синтетические среды позволили смоделировать процесс формирования биопленки бактериями Pseudomonas aeruginosa. К признакам формирования биопленки на синтетической среде можно отнести, наличие альгинатного экзополимерного матрикса, стадийность формирования биопленки, изменение вязкости среды, а также наличие или отсутствие пигментации. Введение полигексаметиленгуанидина гидрохлорида в жидкую синтетическую среду, способствовало гибели жизнеспособных клеток биопленки, образованной бактериями Pseudomonas aeruginosa. Была выявлена рабочая концентрация и минимальная летальная доза данного вещества. Так же в процессе проведения эксперимента, авторами выявлена способность супернатанта, полученного из бульонной культуры бактерии Pseudomonas aeruginosa, активировать клетки персистеры в среде, обработанной минимальной летальной дозой полигексаметиленгуанидином гидрохлоридом.

Список литературы:

1. Balaban N. Q. Bacterial Persistence as a Phenotypic Switch / N. Q. Balaban, [et. al.] // Science. – 2004. – Vol. 305, № 5690. – P. 1622–1625.

2. Biofilms, Infection, and Antimicrobial Therapy / ed. J. L. Pace, [et. al.]. – Boca Raton: Taylor & Francis Group, 2006. – 495 p.

3. Keren I. Persister cells and tolerance to antimicrobials / I. Keren, [et. al.] // FEMS Microb. Let. – 2004. – No. 230. – P. 13–18.

4. Keren I. Specialized Persister Cells and the Mechanism of Multidrug Tolerance in Escherichia coli / I. Keren, [et. al.] // J. Of Bact. – 2004. – Vol. 186, No. 24. – P. 8172–8180.

5. Maciej Walczak. The effect of polyhexamethylene guanidine hydrochloride (PHMG) derivatives introduced into polylactide (PLA) on the activity of bacterial enzymes / Maciej Walczak, Agnieszka Richert, Aleksandra Burkowska-But // Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology. – 2014. – No. 52. – С. 1719–1724.

6. Mizunoe Y., Wai S. N., Ishikawa T. Resuscitation of viable but nonculturable cells of Vibrio parahaemolyticus induced at low temperature under starvation. FEMS Microbiol. Lett. 2000. – No. 186(1). – P. 115–120.

7. Mukamolova G. V., Kaprelyants A. S., Kell D. B. Secretion of an antibacterial factor during resuscitation of dormant cells in Micrococcus luteus cultures held in an extended stationary phase. Antonie Van Leeuwenhoek. – 1995. – No. 67(3). – P. 289–95.

8. Pitonzo B. J., Amy P. S., Rudin M. Resuscitation of microorganisms after gamma irradiation. Radiat. Res., 1999. – No. 152(1). – P. 71–75.

9. Tetz V. V. The effect of antimicrobial agents and mutagen on bacterial cells in colonies. Med Microbiol. Lett. – 1996. – No. 5. – P. 426–436.

10. Wai S. N., Moriya T., Kondo K. et al. Resuscitation of Vibrio cholerae O1 strain TSI-4 from viable but nonculturable state by heart shock. FEMS Microbiol. Lett. – 1996. – No. 136(2). – P. 187–189.

11. Батраков В. В. Влияние L-аргинина на формирование внеклеточного полимерного матрикса бактериями Pseudomonas aeruginosa / В. В. Батраков, А. Г. Шестаков, Е. С. Малинов, Д. А. Васильев // Ульяновск: XXVIII Любищевские чтения: Современные проблемы эволюции и экологии, 2014. – C. 266–268.

12. Малинов Е. С. Бактериальные биопленки и методы их получения / Е. С. Малинов, А. Г. Шестаков, Д. А. Васильев // Биотехнология: реальность и перспективы в сельском хозяйстве, 2012. – 202 с.

13. Малинов Е. С. Влияние уксуснокислого свинца на планктонные и биопленочные формы Pseudomonas aeruginosa / Е. С. Малинов, А. Г. Шестаков, Д. А. Васильев // Ветеринария и кормление, 2012. – № 5. – C. 28–30.

14. Сучков Ю. Г., Худяков И. В., Емельяненко Е. Н. О возможности сохранения возбудителя чумы в почве в покоящейся (некультивируемой) форме // Микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. – 1997. – № 4. – С. 42–46.

15. Шестаков А. Г. Среда для стимуляции образования биопленок у бактерий Pseudomonas aeruginosa // Научная жизнь, 2011. – № 5. – C. 22–27.

16. Шлеева М. О., Мукамолова Г. В., Телков М. В. и др. Образование «некультивируемых» клеток Mico­bacteriumtuberculosisи их оживление // Микробиология. – 2003. – № 72(1). – С. 76–83.

EFFECT OF POLYHEXAMETHYLENE GUANIDINE HYDROCHLORIDE ON BIOFILMS FORMED BY PSEUDOMONAS AERUGINOSA BACTERIA IN A LIQUID SYNTHETIC MEDIUM AND THE SUBSEQUENT FORMATION OF PERSISTERS

Malinov Evgeniy Sergeevich, contender, Researcher, Ulyanovsk State Agrarian University, Ulyanovsk, Russia.

Shestakov Andrey Gennadyevich, Cand. of Biol. Sci., Ass. Prof., Ulyanovsk State Agrarian University, Ulyanovsk, Russia.

Molofeeva Nadezhda Ivanovna, Cand. of Biol. Sci., Ass. Prof., Ulyanovsk State Agrarian University, Ulyanovsk, Russia.

Merchina Svetlana Vasilyevna, Cand. of Biol. Sci., Ass. Prof., Ulyanovsk State Agrarian University, Ulyanovsk, Russia.

Vasilyev Dmitriy Arkadyevich, Dr. of Biol. Sci., Prof., Head of Depart., Ulyanovsk State Agrarian University, Ulyanovsk, Russia.

Keywords: Pseudomonas auruginosa, polyhexamethylene guanidine hydrochloride, persisters, biofilm, supernatant.

Abstract. The work was performed at the Department of microbiology, virology, epizootiology and veterinary and sanitary expertise of the Ulyanovsk State Agrarian University. We used traditional microbiological methods and biological models and methods developed by the authors. In the course of the experiment, the authors used the reference bacterial strain Pseudomonas aeruginosa by the “GISK” named after L. A. Tarasevich 1677, obtained from the  Microbiology Department culture stock centre. The purpose of this work was to study the effect of polyhexamethylene guanidine hydrochloride on biofilms formed by the bacteria Pseudomonas aeruginosa in an artificially created model of a complete biofilm and the subsequent formation of persisters. This article describes the results of scientific research on the use of polyhexamethylene guanidine hydrochloride as a means of destruction of the biofilm formed by the bacteria Pseudomonas aeruginosa and the  effects of the  supernatant on the subsequent formation of persister cells. The author’s technique and developed synthetic media allowed us to model the process of biofilm formation by the bacteria Pseudomonas aeruginosa. Signs of biofilm formation on a synthetic medium include the  presence of an alginate exopolymeric matrix, the stages of biofilm formation, a change in the viscosity of the medium, and the presence or absence of pigmentation. The introduction of polyhexamethylene guanidine hydrochloride into a liquid synthetic medium promoted the death of viable cells of the biofilm formed by the bacteria Pseudomonas aeruginosa. The  working concentration and the minimum lethal dose of the substance were identified. Also in the course of the experiment, the authors identified the ability of the supernatant obtained from the broth culture of the bacterium Pseudomonas aeruginosa to activate the persists cells in the medium treated with the minimum lethal dose of polyhexamethyleneguanidine hydrochloride.

REFERENCES

1. Balaban N. Q. Bacterial Persistence as a Phenotypic Switch / N. Q. Balaban, [et. al.] // Science. – 2004. – Vol. 305, No. 5690. – P. 1622–1625.

2. Biofilms, Infection, and Antimicrobial Therapy / ed. J. L. Pace, [et. al.]. – Boca Raton: Taylor & Francis Group, 2006. – 495 p.

3. Keren I. Persister cells and tolerance to antimicrobials / I. Keren, [et. al.] // FEMS Microb. Let. – 2004. – No. 230. – P. 13–18.

4. Keren I. Specialized Persister Cells and the Mechanism of Multidrug Tolerance in Escherichia coli / I. Keren, [et. al.] // J. Of Bact. – 2004. – Vol. 186, No. 24. – P. 8172–8180.

5. Maciej Walczak. The effect of polyhexamethylene guanidine hydrochloride (PHMG) derivatives introduced into polylactide (PLA) on the activity of bacterial enzymes / Maciej Walczak, Agnieszka Richert, Aleksandra Burkowska-But // Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology. – 2014. – No. 52. – P. 1719–1724.

6. Mizunoe Y., Wai S. N., Ishikawa T. Resuscitation of viable but nonculturable cells of Vibrio parahaemolyticus induced at low temperature under starvation. FEMS Microbiol. Lett. 2000. – No. 186(1). – P. 115–120.

7. Mukamolova G. V., Kaprelyants A. S., Kell D. B. Secretion of an antibacterial factor during resuscitation of dormant cells in Micrococcus luteus cultures held in an extended stationary phase. Antonie Van Leeuwenhoek. – 1995. – No. 67(3). – P. 289–95.

8. Pitonzo B. J., Amy P. S., Rudin M. Resuscitation of microorganisms after gamma irradiation. Radiat. Res., 1999. – 152(1). – P. 71–75.

9. Tetz V. V. The effect of antimicrobial agents and mutagen on bacterial cells in colonies // Med Microbiol. Lett. – 1996. – No.5. – P. 426–436.

10. Wai S. N., Moriya T., Kondo K. et al. Resuscitation of Vibrio cholerae O1 strain TSI-4 from viable but nonculturable state by heart shock // FEMS Microbiol. Lett. – 1996. – No. 136(2). – P. 187–189.

11. Batrakov V. V. The influence of L-arginine on the formation of the extracellular polymer matrix by the bacteria Pseudomonas aeruginosa / V. V. Batrakov, A. G. Shestakov, E. S. Malinov, D. A. Vasilyev // Ulyanovsk: XXVIII LYUBISHCHIE READINGS : Modern Problems of Evolution and Ecology, 2014. – Pp. 266–268.

12. Malinov E. S. Bacterial biofilms and methods for their production / E. S. Malinov, A. G. Shestakov, D. A. Vasiliev // Biotechnology: Reality and Prospects in Agriculture, 2012. – 202 p.

13. Malinov E. S. The influence of lead acetate on planktonic and biofilm forms of Pseudomonas aeruginosa / E. S. Malinov, A. G. Shestakov, D. A. Vasiliev // Veterinary medicine and feeding, 2012. – No. 5. – P. 28–30.

14. Suchkov Yu. G., Khudyakov I. V., Emelyanenko E. N. On the possibility of preserving the causative agent of the plague in the soil in a resting (uncultivated) form // Journal microbiol., epidemiol. and immunobiol. – 1997. – No. 4. – P. 42–46.

15. Shestakov A. G. Environment to stimulate the formation of biofilms in bacteria Pseudomonas aeruginosa // Scientific Life, 2011. – No. 5. – P. 22–27.

16. Shleeva M. O., Mukamolova G. V., Telkov V. V., et al. Formation of “uncultivated” Micobacterium tuberculosis cells and their revival // Microbiology. – 2003. – No. 72 (1). – P. 76–83.