Сульдина Е. В., Раксина И. С., Молофеева Н. И., Мерчина С. В., Калдыркаев А. И., Шестаков А. Г., Савина Е. В. Разработка и оптимизация видоспецифичной праймерной системы для детекции Listeria welshimeri методом ПЦР-РВ // Научная жизнь. 2025. Т. 20. Вып. 5 (143). С. 1354-1364. DOI: 10.35679/1991-9476-2025-20-5-1354-1364

Сульдина Екатерина Владимировна, ст. преподав. кафедры «Микробиология, вирусология, эпизоотология и ветеринарно-санитарная экспертиза», ФГБОУ ВО «Ульяновский государственный аграрный университет им. П. А. Столыпина»: Россия, 432017, Ульяновская обл., г. Ульяновск, бульвар Новый Венец, 1.
Раксина Иванна Семеновна, канд. ветеринар. наук, ст. преподав. кафедры «Микробиология, вирусология, эпизоотология и ветеринарно-санитарная экспертиза», ФГБОУ ВО «Ульяновский государственный аграрный университет им. П. А. Столыпина»: Россия, 432017, Ульяновская обл., г. Ульяновск, бульвар Новый Венец, 1.
Молофеева Надежда Ивановна, канд. биол. наук, доцент, доцент кафедры «Микробиология, вирусология, эпизоотология и ветеринарно-санитарная экспертиза», ФГБОУ ВО «Ульяновский государственный аграрный университет им. П. А. Столыпина»: Россия, 432017, Ульяновская обл., г. Ульяновск, бульвар Новый Венец, 1.
Мерчина Светлана Васильевна, канд. биол. наук, доцент, доцент кафедры «Микробиология, вирусология, эпизоотология и ветеринарно-санитарная экспертиза», ФГБОУ ВО «Ульяновский государственный аграрный университет им. П. А. Столыпина»: Россия, 432017, Ульяновская обл., г. Ульяновск, бульвар Новый Венец, 1.
Калдыркаев Андрей Иванович, канд. биол. наук, доцент, доцент кафедры «Микробиология, вирусология, эпизоотология и ветеринарно-санитарная экспертиза», ФГБОУ ВО «Ульяновский государственный аграрный университет им. П. А. Столыпина»: Россия, 432017, Ульяновская обл., г. Ульяновск, бульвар Новый Венец, 1.
Шестаков Андрей Геннадьевич, канд. биол. наук, доцент, доцент кафедры «Микробиология, вирусология, эпизоотология и ветеринарно-санитарная экспертиза», ФГБОУ ВО «Ульяновский государственный аграрный университет им. П. А. Столыпина»: Россия, 432017, Ульяновская обл., г. Ульяновск, бульвар Новый Венец, 1.
Савина Елена Владимировна, канд. с.-х. наук, доцент, доцент кафедры «Морфология и физиология, кормление, разведение и частная зоотехния», ФГБОУ ВО «Ульяновский государственный аграрный университет им. П. А. Столыпина»: Россия, 432017, Ульяновская обл., г. Ульяновск, бульвар Новый Венец, 1.

Тел.: (937) 454-56-51
E-mail: e.suldina2006@yandex.ru

В статье представлена информация по разработке и оптимизации высокоспецифичной праймерной системы для молекулярной детекции Listeria welshimeri с использованием метода полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (ПЦР-РВ). Несмотря на то, что L. welshimeri традиционно считается непатогенным видом, его широкое распространение в пищевых продуктах и окружающей среде, а также высокое геномное сходство с L. monocytogenes, обуславливают необходимость его мониторинга. В качестве мишени для амплификации был выбран уникальный геномный локус, кодирующий белок, родственный семейству FusB/FusC, отвечающий за устойчивость к фузидовой кислоте. Анализ пяти аннотированных геномов L. welshimeri в базе GenBank подтвердил отсутствие гомологии этого локуса у других представителей рода Listeria. Дизайн праймеров (LwF2: 5′-TATTCCCGGCGAACGTGCTA-3′ и LwR2: 5′-CGCGCATATCCAGTTTAGACCA-3′) выполнен с использованием официального инструмента Primer-BLAST (NCBI), который обеспечивает высокую специфичность подбора олигонуклеотидов. Оптимизация условий ПЦР-РВ включала подбор температуры отжига (55 °C) и концентрации MgCl₂ (оптимально - 1,5 мкл 50 мМ раствора на реакцию). Специфичность разработанной системы праймеров подтверждена на панели из семи видов бактерий рода Listeria, положительный сигнал наблюдался только при использовании ДНК L. welshimeri, что подтверждает 100 % видовую специфичность. Чувствительность метода составила 10² КОЕ/мл, что обеспечивает надёжное выявление даже низких концентраций микроорганизма. Разработанная праймерная система представляет собой надёжный инструмент для экологического, пищевого и, при необходимости, клинического скрининга L. welshimeri. Её применение позволит улучшить контроль за микробным составом пищевых цепочек, изучить роль непатогенных листерий в микробных сообществах и оценить потенциальные риски, связанные с генетической мобильностью бактерий рода Listeria. Работа вносит существенный вклад в стандартизацию молекулярно-диагностических подходов к идентификации непатогенных, но значимых видов.

Список литературы:

1. Liu, D. Identification, subtyping and virulence determination of Listeria monocytogenes, an important foodborne pathogen / D. Liu // Journal of Medical Microbiology. – 2006. – Vol. 55, No. 6. – P. 645-659. – DOI 10.1099/jmm.0.46495-0. – EDN MFICQL.
2. Salamina G. et al. A foodborne outbreak of gastroenteritis involving Listeria monocytogenes //Epidemiology & Infection. – 1996. – Т. 117, №. 3. – С. 429-436.
3. Seeliger H. P. R. Section 14. Genus Listeria // Bergey's manual of systematic bacteriology. – 1986. – Vol. 2. – 1242.
4. Vázquez-Boland J. A., Kuhn M., Berche P., Chakraborty T., DomínguezBernal G., Goebel W., González-Zorn B., Wehland J., Kreft J. Listeria pathogenesis and molecular virulence determinants. Clin Microbiol Rev 2001. 14:584–640. https://doi.org/10.1128/CMR.14.3.584-640.2001
5. Núñez-Montero K., Leclercq A., Moura A., Vales G., Peraza J., Pizarro-Cerdá J., Lecuit M. Listeria costaricensis sp. nov. Int J Syst Evol Microbiol 2018. 68:844–850. https://doi.org/10.1099/ijsem.0.002596
6. Doijad S. P., Poharkar K. V., Kale S. B., Kerkar S., Kalorey D. R., Kurkure N. V., Rawool D. B., Malik S. V. S., Ahmad R. Y., Hudel M., Chaudhari S. P., Abt B., Overmann J., Weigel M., Hain T., Barbuddhe S. B., Chakraborty T. Listeria goaensis sp. nov. Int J Syst Evol Microbiol 2018. 68:3285–3291. https:// doi.org/10.1099/ijsem.0.002980
7. Leclercq A., Moura A., Vales G., Tessaud-Rita N., Aguilhon C., Lecuit M. 2019. Listeria thailandensis sp. nov. Int J Syst Evol Microbiol 69:74–81. https:// doi.org/10.1099/ijsem.0.003097
8. Quereda J. J., Leclercq A., Moura A., Vales G., Gómez-Martín Á., GarcíaMuñoz Á., Thouvenot P., Tessaud-Rita N., Bracq-Dieye H., Lecuit M. Listeria valentina sp. nov., isolated from a water trough and the faeces of healthy sheep. Int J Syst Evol Microbiol 2020. 70:5868–5879. https://doi.org/10. 1099/ijsem.0.004494
9. Carlin C. R., Liao J., Weller D. L., Guo X., Orsi R., Wiedmann M. Listeria cossartiae sp. nov., Listeria farberi sp. nov., Listeria immobilis sp. nov., Listeria portnoyi sp. nov. and Listeria rustica sp. nov., isolated from agricultural water and natural environments. Int J Syst Evol Microbiol 2021. 71:004795. https://doi.org/10.1099/ijsem.0.004795
10. Raufu I. A., Moura A., Vales G., Ahmed O. A., Aremu A., Thouvenot P., TessaudRita N., Bracq-Dieye H., Krishnamurthy R., Leclercq A., Lecuit M. Listeria Ilorinensis sp. nov., isolated from cow milk cheese in Nigeria. Int J Syst Evol Microbiol 2022.72. https://doi.org/10.1099/ijsem.0.005437
11. Carlin C.R., Liao J., Hudson L.K., Peters T.L., Denes T.G., Orsi R.H., Guo X., Wiedmann M. 2022. Soil collected in the great smoky mountains National Park yielded a novel Listeria sensu stricto species L. swaminathanii. Microbiol Spectr 10:e0044222. https://doi.org/10.1128/ spectrum.00442-22
12. Liao J., Guo X., Weller D.L., Pollak S., Buckley D. H., Wiedmann M., Cordero O.X. 2021. Nationwide genomic atlas of soil-dwelling listeria reveals effects of selection and population ecology on pangenome evolution. Nat Microbiol 6:1021–1030. https://doi.org/10.1038/s41564-021-00935-7
13. Listeria ilorinensis sp. nov., isolated from cow milk cheese in Nigeria / I. A. Raufu, O. A. Ahmed, A. Moura [et al.] // International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. – 2022. – Vol. 72, No. 6. – P. 005437. – DOI 10.1099/ijsem.0.005437. – EDN QETGHX.
14. Comparative genomic analysis of pathogenic factors of Listeria spp. using whole-genome sequencing / Yu. Qi, Q. Cao, X. Zhao [et al.] // BMC Genomics. – 2024. – Vol. 25, No. 1. – P. 935. – DOI 10.1186/s12864-024-10849-3. – EDN FVIWGV.
15. Antibacterial and anti-biofilm of epsilon-poly-lysine hydrochloride on Listeria monocytogenes and its application on refrigerated beef / J. Fang, X. Hong, H. Lu, Ju. Zhu // Journal of Food Processing and Preservation. – 2022. – Vol. 46, No. 10. – DOI 10.1111/jfpp.16915. – EDN ZSNSTX.
16. Multiple-Locus Variable-Number Tandem Repeat Analysis Genotypes of Listeria monocytogenes Isolated from Farms, Abattoirs, and Retail in Gauteng Province, South Africa / Ja. Gana, N. Gcebe, R. Pierneef [et al.] // Journal of Food Protection. – 2022. – Vol. 85, No. 9. – P. 1249-1257. – DOI 10.4315/jfp-22-081. – EDN JSAMMU.
17. Gilot P., Content J. Specific identification of Listeria welshimeri and Listeria monocytogenes by PCR assays targeting a gene encoding a fibronectin-binding protein //Journal of Clinical Microbiology. – 2002. – Т. 40. – №. 2. – С. 698-703.

DEVELOPMENT AND OPTIMIZATION OF A SPECIES-SPECIFIC PRIMER SYSTEM FOR DETECTION OF LISTERIA WELSHIMERI BY PCR-RV

Suldina Ekaterina Vladimirovna, Senior Lecturer of the Depart. of Microbiology, virology, epizootology and veterinary and sanitary examination, Ulyanovsk state agrarian university named after P.A. Stolypin, Ulyanovsk, Russia.
Raksina Ivanna Semyonovna, Cand. of Vet. Sci., Senior Lecturer of the Depart. of Microbiology, virology, epizootology and veterinary and sanitary expertise, Ulyanovsk state agrarian university named after P.A. Stolypin, Ulyanovsk, Russia.
Molofeeva Nadezhda Ivanovna, Cand. of Biol. Sci., Ass. Prof., Ass. Prof. of the Depart. of Microbiology, virology, epizootology and veterinary and sanitary examination, Ulyanovsk state agrarian university named after P.A. Stolypin, Ulyanovsk, Russia.
Merchina Svetlana Vasilyevna, Cand. of Biol. Sci., Ass. Prof., Ass. Prof. of the Depart. of Microbiology, virology, epizootology and veterinary and sanitary expertise, Ulyanovsk state agrarian university named after P.A. Stolypin, Ulyanovsk, Russia.
Kaldyrkaev Andrey Ivanovich, Cand. of Biol. Sci., Ass. Prof., Ass. Prof. of the Depart. of Microbiology, virology, epizootology and veterinary and sanitary expertise, Ulyanovsk state agrarian university named after P.A. Stolypin, Ulyanovsk, Russia.
Shestakov Andrey Gennadievich, Cand. of Biol. Sci., Ass. Prof., Ass. Prof. of the Depart. of Microbiology, virology, epizootology and veterinary and sanitary expertise, Ulyanovsk state agrarian university named after P.A. Stolypin, Ulyanovsk, Russia.
Savina Elena Vladimirovna, Cand. of Agr. Sci., Ass. Prof., Ass. Prof. of the Depart. of Morphology and physiology, feeding, breeding and private animal science, Ulyanovsk state agrarian university named after P.A. Stolypin, Ulyanovsk, Russia.

Keywords: Listeria, Listeria welshimeri, pathogen, polymerase chain reaction, PCR-RV.

Abstract. The article provides information on the development and optimization of a highly specific primer system for the molecular detection of Listeria welshimeri using real-time polymerase chain reaction (PCR-RV). Despite the fact that L. welshimeri is traditionally considered a non-pathogenic species, its widespread distribution in food and the environment, as well as its high genomic similarity to L. monocytogenes, necessitate its monitoring. A unique genomic locus encoding a protein related to the FusB/FusC family responsible for resistance to fusidic acid was selected as a target for amplification. Analysis of five annotated L. genomes welshimeri in the GenBank database confirmed the absence of homology of this locus in other representatives of the genus Listeria. The design of the primers (LwF2:5'-TATTCCCGGCGAACGTGCTA-3' and LwR2:5'-CGCGCATATCCAGTTTAGACCA-3') was performed using the official Primer-BLAST (NCBI) tool, which provides high specificity of oligonucleotide selection. Optimization of the PCR-RV conditions included selection of the annealing temperature (55 °C) and MgCl₂ concentration (optimal - 1.5 µl of 50 mM solution per reaction). The specificity of the developed primer system was confirmed on a panel of seven bacterial species of the genus Listeria, a positive signal was observed only when using L. welshimeri DNA, which confirms 100% species specificity. The sensitivity of the method was 102 CFU/ml, which ensures reliable detection of even low concentrations of the microorganism. The developed primer system is a reliable tool for environmental, nutritional and, if necessary, clinical screening of L. welshimeri. Its application will improve the control of the microbial composition of food chains, study the role of non-pathogenic listeria in microbial communities and assess the potential risks associated with the genetic mobility of bacteria of the genus Listeria. The work makes a significant contribution to the standardization of molecular diagnostic approaches to the identification of non-pathogenic but significant species.